組換えPvfpの溶液構造

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 5、記事番号: 739 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

一部の海洋生物は水性潮汐環境に耐性があり、濡れた表面にしっかりと付着します。この動作により、医学、生体材料、組織工学における潜在的な応用に対する注目が高まっています。ムール貝では、岩への接着力は足糸と呼ばれるタンパク質の繊維形成の結果です。我々は、アジアミドリイガイ Perna viridis が分泌する 3 つの足根プラークタンパク質の 1 つである Pvfp-5β の溶液構造を示し、基質との相互作用の開始に関与する成分を示します。我々は、Pvfp-5βが、2つのEGFモチーフの配列中に存在することと一致して、安定に折りたたまれた構造を有することを実証する。この構造は、μs-ms 時間スケールでの遅い局所運動の影響を受ける少数の残基を除いて非常に剛性が高く、EGF モジュールの相対的な配向について人工知能手法によって計算されたモデルとは異なりますが、これは計算手法ではまだ性能が劣るものです。。また、Pvfp-5βはDOPA修飾がなくてもコアセルベートできることも示し、接着性イガイタンパク質の接着機構の理解と生体材料の開発の両方に洞察を与えます。

ムール貝、ヒトデ、砂城虫などの海洋生物が、潮流や荒波の強さに耐えるために、どのようにして濡れた表面にしっかりと付着することができるのかは、関心が高まっているテーマです1。これは、高価な表面メンテナンスを必要とする表面の腐食を促進するため、表面の生物付着が大きな懸念事項である海軍産業にとってこの特性が重要であるためだけではありません。さらに興味深いのは、このような強固な接着メカニズムを完全に理解することは、再生医療、組織工学、および材料科学で利用できる特性を備えた新しい生体材料の開発に影響を与える可能性があるということです2,3。

付着特性を持つ海洋生物の中には、足糸と呼ばれるタンパク質ベースの糸状付属器の分泌を通じて、水中で強力に付着するための戦略を開発した貝類があります。これは、互いに絡み合った繊維の束によって形成されたフィラメントで構成されています4。各フィラメントは、接着機能を特徴とするイガイ足タンパク質（mfps）を含むタンパク質が豊富なプラークで終わり、これが耐水性接着剤として機能し、繊維をさまざまな基材にしっかりと固定できるようにします5、6。化学的には、足糸の組成はいくつかの異なるタンパク質で構成されており、これらはすべてイガイの足部で合成されます。イガイの足は、淡水においてイガイが基質を突き抜けて移動することを可能にする大きな器官です。足糸は足の腹側表面の溝で生成され、粘性の分泌物として滲出します。これは、Aβペプチドのアミロイド線維の形成と類似したコアセルベーションプロセスで、水と接触すると徐々に硬化して線維を形成します7。

最も研究されている Mytilus 属では 6 つのイガイ足タンパク質が同定されています (mfp-2、-3S、-3F、-4、-5、および -6)8。この生物由来のタンパク質は、弱い接着エネルギー (<5 mN/m) と生分解性であるため環境に優しいという特性を持ち 9、通常は無毒で免疫応答特性が低い 10。イガイの足のタンパク質の特徴は、翻訳後修飾によって得られるチロシンの誘導体であるカテコールアミノ酸 3,4-ジヒドロキシ-1-フェニルアラニン (DOPA) を含んでいることです 11。 DOPA は、水素結合、疎水性相互作用、金属配位、共有結合を形成する能力を通じて、さまざまな基質に結合することが知られています 12,13,14,15,16。したがって、これまで多くの研究が DOPA 由来ポリマーに焦点を当ててきました。新しい接着性生体材料の開発。

以前の研究で、我々はアジアミドリイガイ Perna viridis の mfp タンパク質の 1 つ (Pvfp-5β) の非 DOPA 修飾バージョンを特徴付けました 17。 Pvfp-3α や Pvfp-6 も含むこの生物によって産生されるタンパク質の中で、Pvfp-5β が最初に分泌され、基質との相互作用を確立するため、特に興味深いシステムとなっています 18。このタンパク質の配列には、EGF モジュールと高い相同性を持つ 2 つのタンデムリピートが含まれており、Notch リガンド Δ様 1 タンパク質の EGF リピートと 47 ～ 50% の同一性を共有します 17,18。 EGF モチーフは、カルシウムイオンを結合している可能性のある 3 つの保存されたジスルフィド架橋を特徴とする全βタンパク質であり、Mytilus galloprovincialis の Mgfp-2 などの他のイガイ接着タンパク質でも観察されています 12,19,20。我々は、細菌内で組換え Pvfp-5β を生産することが可能であること、また Pvfp-5β が DOPA 修飾の非存在下でも低毒性と固有の接着特性を備えていることを実証し 17、このタンパク質を細胞の表面コーティング生体材料として使用する可能性を確信させました。損傷した組織の再生を含む医療用途。これらの結果は、強力な耐湿性接着を生み出すために DOPA 置換残基は必要ではなく、DOPA アミノ化タンパク質は対応する非ドーパミン化バージョンより高い接着特性を持たないことを実証した他の研究によっても裏付けられています 5,21。 22. 我々の結果は、イガイの接着におけるリジン残基（Lys）の重要性を強調した最近の研究とも一致しています23、24、25、26。実際、DOPA とチロシンは両方とも、リジンなどの隣接する正に帯電した残基とカチオン - π 結合を形成する傾向があり、これにより mfps の吸着層の凝集力が増加し、タンパク質が豊富な層の自発的な液-液相分離が誘発されると考えられています。塩溶液中の流体相（複合コアセルベーション）27、28、29。

最近では、別の研究で、DOPA 修飾 Pvfp-5β と未修飾 Pvfp-5β の両方がほとんど構造化されておらず、海水のような条件下では DOPA 修飾 Pvfp-5β のみが液液相分離 (LLPS) を示しました。 Tyr のみのバージョンは、不溶性凝集体のみを形成します 30。これらの結果は、私たちのデータと矛盾しており、2 つの重要な疑問が生じます。タンパク質が構造化されていない場合、なぜ Nature は、ジスルフィド架橋のおかげでも安定に折りたたまれることがよく知られている EGF フォールドを使用したのでしょうか? DOPA は、イガイ由来の新しい生体接着剤を開発するための唯一のパラダイムですか?

これらの問題を探求するために、我々は、溶液中の Pvfp-5β の三次元構造を解明し、適切な疎水性コアが存在しないにもかかわらず、その構造が確立されていることを確認することにより、Pvfp-5β の接着特性の構造決定要因を理解する可能性という重要な一歩を踏み出しました。溶液中では比較的硬く、局所的なスローモーションのみです。また、未修飾の Pvfp-5β が中性または塩基性 pH で単純なコアセルベーションを受ける可能性があることを実験的に証明し、分子ドッキングによる Pvfp-5β の自己集合によって引き起こされるコアセルベーションプロセスを描写します。

私たちの結果は、イガイタンパク質の接着特性の構造的決定要因をより深く理解するための基礎を提供します。

以前に公開された未修飾 Pvfp-5β の 2D 1H-15N HSQC NMR スペクトルでは、タンパク質が安定に折りたたまれ、単量体であり、9.7 ～ 6.7 ppm の範囲にわたるピーク分散を示していることにほとんど疑問が残りません (補足図 S1)。次に、Pvfp-5βの溶液中での三次元NMR構造の決定を進めることにしました。注目すべきは、我々の組換え Pvfp-5β の HSQC スペクトルが、ほとんど構造化されていないタンパク質と一致する、別のグループによって最近発表されたものとはかなり異なることです 30。 Pvfp-5βの溶液中での三次元NMR構造の決定は、タンパク質のサイズが小さいにもかかわらず、容易な作業ではありませんでした。これは、チロシン (20.5%) およびプロリン (9.6%) の含有量が高いため、NMR スペクトルの割り当てには多大な労力が必要だったためです。それにもかかわらず、実質的に完全な割り当てを達成することができ（補足図S1）、Pro12を除いて、Pvfp-5βアミノ酸残基のほぼすべての側鎖が正常に割り当てられました。この割り当ては、アクセッション番号 51091 で BMRB データベースに送信されました。

興味深いことに、12のシステインの化学シフトはすべてその酸化型と互換性のある値を持っていることに気づきました（補足表1）。これは、6つのシステインのうち5つのみの形成を確認した質量分析によるジスルフィド架橋の以前の決定とは異なります。可能な橋17．しかし、鎖全体に沿った残基のいくつかの共鳴が、期待値からかなり大きく逸脱していることに気づきました。したがって、予防措置として、まず MS によって検出された 5 つのジスルフィド結合 (C13 ～ C29、C31 ～ C40、C45 ～ C56、C50 ～ C67、および C69 ～ C7817) のみを適用して ARIA 計算を実行しました。得られたエネルギー的に最良の 20 個の構造のバックボーン二乗平均平方根偏差 (RMSD) は、すべての残基を考慮すると 1.43 +/- 0.39 Å、秩序あるトラクトに含まれる残基のみを考慮すると 1.17 +/- 0.25 Å でした (3 ～ 4、6) 、8 ～ 34、36 ～ 38、41 ～ 59、および 61 ～ 82）。最終的な構造アンサンブルでは、0.5 Åを超える距離制限の8つの違反が目立ち、特性1〜11および18〜30の重複が不十分でした（補足図S2）。

Pvfp-5βの全体構造は相同性基準から予想されるものと一致しており、溶媒にさらされた2つの逆平行βシートとジスルフィド架橋によって一緒に保持されたランダムコイル領域によって形成された2つのタンデムEGFモジュールの存在を示しています（補足図S2）。）。最初のモジュールには、EGF 様ドメインに予想される 3 つのジスルフィド架橋のうち 2 つだけが含まれています (C13 ～ C29、C31 ～ C40)。一方、2 番目のモジュールには、予想どおり 3 つのジスルフィド架橋 (C45 ～ C56、C50 ～ C67、および C69 ～) が含まれています。 C78）。構造の残りの部分は、長いランダムコイル領域によって特徴付けられます。これらの予備的な結果は、以前の予測を裏付けて拡張し、タンパク質が折り畳まれて構造化されていることを疑いの余地なく証明しています。

タンパク質の動力学特性とそれに付随する 6 番目のジスルフィド架橋の存在を調査するために、ps-ns 時間スケールでタンパク質の緩和を研究しました。 Pvfp-5β には二次構造要素がほとんど含まれていないにもかかわらず、14.1 および 18.8 T の両方での 15N-R1、15N-R2、および hetNOE の均一な値によって明らかなように、緩和データは比較的剛直なタンパク質であることを示しています (図 1)。低い R1 および比較的高い hetNOE 値とともに、15N-R2 の上昇が、すべて非構造化領域および/またはループに属する残基 C8、N39、Y42、C45、G72、Q77、および Q79 と、以下に属する残基 T18 および Y27 で観察されました。それぞれβ1とβ2に。これは、これらの残差のμs-ms タイムスケール内に高速局所運動がないことを示しています。

14.1 T (青い点) と 18.8 T (赤い点) の両方ですべての Pvfp-5β 残基について測定された 298 K での 15N-R1、15N-R2、hetNOE、および R2/R1 比。 β鎖は図の上部の青い矢印で示され、黄色の曲線はジスルフィド結合を示します。黒の星印はプロリン残基、または NMR 実験で重複するピークを持つ残基を示します。太字の残基は、ms-μs スケール内の非高速局所運動を示しています。

観察された動的特徴がタンパク質に固有のものであり、実験条件から独立していることを確認するために、18.8 T で異なる温度 (288、293、および 303 K) で緩和実験を繰り返しました。結果として得られた hetNOE および R2/R1 比は次のようにプロットされました。各温度では、全体的な傾向に変化は見られませんでした（補足図S3）。データのより信頼性の高い解釈のために、タンパク質の動きの偏りのない定性的画像を与える、スペクトル密度マップアプローチを使用してデータも分析しました31（補足図S4）。この分析によると、Pvfp-5β は剛直なタンパク質に典型的なパターンを示し、残基 2 ～ 4 および 83 のみが柔軟であり、バックボーンの N ～ H ベクトルの動きにほとんど制限がないことがわかります。残基 C8 および T18 はμs-ms の時間スケールで構造交換を経験し、C8 と C19 の間に 6 番目のジスルフィド架橋が存在することを裏付けています。したがって、我々は、His タグ付き Pvfp-5β と比較した以前の MS 結果は、N 末端タグの存在によって影響を受けたに違いなく、N 末端 C8 システインの酸化還元電位に影響を与えた可能性があると結論付けました。残基 Y27、N39、G72、および Q77 もμs-ms の時間スケールで構造交換を経験しますが、残基 N6、G23、および G61 は柔軟と剛体の中間の状況で出現し、依然として J(0 ）。

27 残基の T1/T2 比から 7.8 ns の相関時間が得られ、T1 および T2 値は平均から 1 標準偏差単位以内でした。この値は、9.5 KDa の単量体球状タンパク質で予想される値よりわずかに長いですが、これは、Pvfp-5β の細長い楕円体形状によって正当化され、これは、異方性を示す R2/R1 の配向依存性 32。

これらの観察は、タンパク質の動態に関する貴重な情報を提供し、Pvfp-5β は中性および塩基性 pH では凝集する強い傾向があるが、酸性 pH では単量体タンパク質であるという結論に至りました。

2 番目の構造計算は、動的研究で見つかった追加のジスルフィド架橋 C8-C19 を適用して実行されました。 Pvfp-5β のエネルギー的に最良の 20 個の構造の RMSD は、すべての残基の主鎖原子で 1.42 +/- 0.5 Å ですが、順序付けられた残基 3 ～ 4、6 ～の主鎖原子のみで 1.09 +/- 0.29 Å です。 82 (図 2 および表 1)。新しい構造アンサンブルにより、緩和データと一致して長い N 末端の変動性が低下し、いくつかの一貫した違反が消失し、緩和プロファイルと一致して NMR バンドルの定義が全体的に向上しました。 N 末端ランダムコイルの中央に余分なジスルフィド結合 C8-C19 が存在することは、15N-R2 と hetNOE のより高い値、および残基 C8 での交換寄与の存在とトラクトの半順序を説明します 9- 16. したがって、このバンドルは Pvfp-5β を代表する構造であると考えることができます。構造座標は、アクセッションコード 7QAB で Protein Data Bank に寄託されています。

a 20 個の最低エネルギー構造の重ね合わせ。 b 黄色のジスルフィド架橋を持つ最低エネルギーでの構造の漫画表現。 c チロシン、リジン、アルギニンがそれぞれオレンジ色、青、マゼンタで強調表示された最低エネルギーでの構造の漫画表現。 d 酸性残基は赤色、塩基性は青色の静電表面電位。 e 疎水性表面。

他のEGF様タンパク質と同様に、Pvfp-5βには疎水性コアがほぼ完全に欠如しており、283〜303 Kの範囲で検出されたdδHN / dTの比として定義される温度係数の分析によっても確認されました（補足図S5）。伸長した分子を長軸に沿って表示すると、2つの対向する表面のうちの1つは主に正に帯電します（図2d）。チロシンとリジンの混合物がタンパク質全体に沿って分布しています (図 2c)。予想どおり、非構造化領域およびループに位置する残基のほとんどは dδHN/dT < -5 ppb/K を示し、緩い水素結合を示唆しました 33。両方のβシートに属する残基 K21、Y27、C56、および C67 についても dδHN/dT < –5 ppb/K の値が得られ、これらの残基が溶媒にさらされていることを示しています。残基 T18、K20、R22、S26、K28、Y30、G57、Y64、Y65、K66、および S68 はすべてβシート領域にあり、dδHN/dT > –5 ppb/K を示し、二次構造要素への関与と安定性を確認しました。水素結合。 dδHN / dT > –5の値は、全体的な比較的硬い構造と一致して、βシート間のUターン、ループ内、およびNテールとCテールの両方に位置するいくつかの残基でも観察されました（補足図S5）。）。

構造検証の手段として、Robetta サーバーの RoseTTAFold ソフトウェアを使用して人工知能 (AI) によって Pvfp-5β をモデル化しました 34,35。高い信頼値 (0.92) と 6 つのジスルフィド架橋すべてを備えた 5 つのモデルが得られました。これらのモデルと最終的な実験的構造アンサンブルを比較すると、2つのEGF様モジュール間のインターフェイスに興味深い小さな違いのみが示されており、これはループβ3-β4の違いによりわずかに異なります（補足図S6）。ただし、NMR 実験構造は 2 つの反復間の明確な NOE によって直接サポートされており、機械学習技術の性質そのものからはほとんど期待できない程度の詳細が得られます。人工知能の構造予測能力は非常に高いにもかかわらず、詳細はまだ予測を超えている可能性があります。

以前の研究で、我々は動的光散乱法 (DLS) によって、Pvfp-5β が pH ショック条件下で凝集する傾向があることを実証しました 17。本研究では、アミロイド原線維における分子間β構造の形成に感受性があり 36、コアセルベートに蓄積するチオフラビン T (ThT) 蛍光色素による Pvfp-5β の自己集合プロセスを分析しました。 ThT 蛍光は、Pvfp-5β モノマーをさまざまな pH に曝露した後に形成されるさまざまな種を検出するために、共焦点顕微鏡と蛍光寿命画像顕微鏡 (FLIM) の両方によってモニタリングされました。

Pvfp-5βをアルカリ環境(0.1 M Tris-HCl pH 8、1 M NaCl)に曝露すると、3つの主要なタンパク質種が徐々に出現します。直径約1μm以下のコアセルベーションの液滴の突然の出現が、傷害の直後に観察されます（補足図S7a、補足動画）。サンプルを2時間にわたってモニタリングすると、最終的に原線維構造が出現する、徐々に大きくなるThT陽性種の形成が明らかになります（補足図S7b、c）。対照として、Pvfp-5βをpH 4.5までインキュベートしても、ThT陽性種は生じません（補足図S7d）。

サブミクロンスケールでタンパク質集合体の構造構造を明らかにし、微視的な構造変化の進展を調べるために、FLIM を使用して ThT 蛍光寿命を分析しました 39。これは、環境極性、特定の残基 (例、芳香族) の存在、または β ストランド間の間隔に対して特異的な感受性を持っています 40。水性環境では、ThT の寿命はピコ秒の範囲ですが、粘度が高い媒体ではより長い寿命が測定されます 41。 FLIM 測定は、「方法」セクションで詳述されているフェーザーアプローチを使用して分析されました。フェーザーアプローチは、フィッティング手順で必要とされる特定のモデルを課すことなく、蛍光分子の減衰の全体像を提供します (図 3)42,43。アルカリ環境での ThT 染色 Pvfp-5β の測定により、3 つの異なる ThT 蛍光寿命分布が明らかになり、フェーザープロット（図 3a）内の区別可能な点の雲として特定され、それぞれが 3 つの主要な ThT 陽性種（液滴）の 1 つに対応します。コアセルベート、中程度のサイズの集合体、およびフィブリル状種）。 Pvfp-5β サンプルの各 ThT 寿命は二重指数関数的減衰によって特徴付けられ、その主成分は ThT 染色されたアミロイド構造で以前に発見されている τ1 = 0.4 ns および τ2 = 2.4 ns の特徴的な寿命を持っています（図 3a）44。最も速い減衰は、特異性の低い結合部位によるものでした。このような場合、環境粘度の増加により ThT 蛍光が発生します。減衰が遅いのは、ThT と分子間 β 構造の間のより特異的な相互作用により、ThT 結合部位により多くの制約が追加され、柔軟性が低下するためであると考えられます。容易に形成されるミクロンスケールの球状タンパク質凝縮物ではより短い寿命が測定され、コアセルベーションの液滴の性質が明らかになりました（図3d）。 ThT寿命は、より大きな種ほど徐々に長くなり、その結果、原線維形態の構造ではより長くなり、充填された/高密度の分子間β構造を示します（図3e、f）。これらの結果は、非修飾 Pvfp-5β が海水のような条件下で LLPS を示すことを明確に示しており、DOPA 修飾 Pvfp-5β のみが LLPS を示し、非修飾バージョンは不溶性凝集体のみを形成することを示す最近の研究とは異なります。

0.1 M Tris-HCl pH 8、1 M NaCl 中の 1 mg/ml Pvfp-5β の ThT シグナルに対する 256 × 256 ピクセル FLIM 測定のフェーザー分析。サンプル中に存在するさまざまな種の画像から得られたフェーザープロット。座標 g と s は、フェーザプロットの各点のサイン変換と 30 コサイン変換にそれぞれ対応します。色付きの円形カーソルで強調表示されている 3 つの区別可能な寿命分布が明白で、特徴的な寿命が 2.4 ns と 0.4 ns の 2 つの単指数減衰フェーザを接続する直線 (黄色の破線) 上にあります。 b、c、d それぞれコアセルベート液滴、中程度のサイズの凝集体、およびフィブリルの低強度（青）から高強度（赤）までの蛍光強度画像。 e、f、g 寿命マップ: 各ピクセルはカーソルの対応するカラーコードに従って色付けされ、フェーザプロット a) の寿命分布を強調表示します。

イガイの接着で起こる Pvfp-5β コアセルベーションプロセスの図的な印象を得るために、Pvfp-5β の実験的構造を使用して Pvfp-5β/Pvfp-5β 二量体の分子ドッキングを実行し、どの表面が自己集合を開始できるかを予測しました。。 HADDOCK によるダイマーのドッキングにより 3 つのクラスターが生成され、その中で最初のクラスターは最も多く存在しており (177 構造)、最高の HADDOCK と Z スコアを持ち、全体の低エネルギー構造からの合計 RMSD は 0.6 ± 0.3 Å でした (補足)表2)。得られたダイマーは、両モノマーの Y27、Y62、および Y65 を含むよく構造化された疎水性コアを備えた D2 対称軸で頭から尾まで配置されます (図 4)。この複合体は、多くのπ-π相互作用およびカチオン-π相互作用と、2つのモノマー間の界面の水素結合の拡張ネットによって安定化されます（補足表3）。二量体間のさらなるドッキングは、二量体の外表面上の追加の露出したチロシンを介して相互作用する可能性があることを示唆している。これは、細長いモノマー構造の配向が繊維軸に対して垂直であることを意味します。

HADDOCK によって計算された Pvfp-5β/Pvfp-5β 二量体の最低エネルギー構造。相互作用に関与する 2 つの成分の残基を棒で示した漫画表現。 b、c 1 つのモノマーの静電表面電位と、もう 1 つのモノマーの漫画表現。

この研究では、足足プラークの形成を介して表面接着に関与するイガイタンパク質の 1 つである Pvfp-5β の溶液中の実験的構造を報告します。タンパク質配列には、リンカーで接続された 2 つのタンデム EGF モジュールが含まれています。 EGF 様モジュールは、3 つの保存されたジスルフィド架橋を特徴とする進化的に保存されたモチーフであり、適切な疎水性コアを含めるには小さすぎる構造を結合します。ジスルフィドが存在するため、ジスルフィドは通常安定に折りたたまれており、膜結合タンパク質の細胞外ドメインや分泌されることが知られているタンパク質に存在します。したがって、それらが Pvfp-5β の構造化タンパク質にもつながると仮定するのは合理的です。

したがって、私たちの研究はこれらの期待を裏付け、より多くの洞察を提供します。まず第一に、Pvfp-5β がランダムコイルタンパク質であると宣言されている一方で、同時に EGF 様モチーフが含まれていると認識されているという文献には多少の混乱があることを明確にする必要があります 17、18、30。 Pvfp-5β が長い非構造化ループを持っているのは事実ですが、同時に EGF を本質的に非構造化タンパク質と考えるのは完全に誤りです。すべての小さなモジュール (約 50 アミノ酸未満) として、ジスルフィド架橋が必要です。いくつかの神経毒やBPTI45に見られるように、所定の位置に保持されます。したがって、CD スペクトルの特徴はランダムコイルの特徴ではなく、単一の最小値が 205 nm (ランダムコイルタンパク質の 200 nm と比較される) にシフトしており、小さいながらもよく構造化された別のタンパク質モジュールの特徴と非常によく似ています。 WW ドメイン 46 は、芳香族側鎖の積み重ねによって引き起こされると考えられる 230 nm 付近のポジティブバンドを Pvfp-5β と共有しています 17。この見解と一致して、我々は分子内 NOE のネットワーク全体を観察し、適切な疎水性コアが存在しない場合でもタンパク質が折りたたまれており、堅牢な構造を持っていることを確信させました。また、酸性条件下では Pvfp-5β が単量体であるという決定的な直接証拠も得ています。

したがって、我々の結果は、チロシン化およびドーパミン化 Pvfp-5β30 の両方について NMR スペクトルが報告されている最近の論文とは大きく異なります。この論文で著者らは、凝集した完全に構造のないタンパク質のすべての特徴を備えた 1 次元および 2 次元のスペクトルを示しました。同じ著者らは NOE を観察できませんでしたが、代わりに単量体 EGF 様タンパク質で予想される NOE を広範囲に観察しました。 Pvfp-5β は、特に細菌内で生成するのが難しいタンパク質であり、強力で信頼性の高いリフォールディングプロトコルによって可溶化する必要がある封入体を形成するため、矛盾が生じる可能性はもちろんあります。

接着および足糸形成を促進するには、Pvfp-5β フォールドの剛性が必要であることが独立して示唆されています。実際、hetNOE などの NMR 緩和パラメーターにより、バックボーンは比較的剛直であり、末端およびループ β1/β2 でのみ観察される ps-ns 時間スケールでの柔軟性が増加していることが明らかにわかります。さらにスペクトル密度マップ分析により、μs-ms 時間スケールの動きによって影響を受けると思われる残基を特定することができました。その中で、β2 と β3 の間の長い無秩序なループにある N39 が最も影響を受けています。したがって、N39 が 2 つの EGF モジュール間のヒンジとして機能すると考えるのが合理的です。リジン残基とチロシン残基は両方とも溶媒にさらされているように見えるため、DOPA 修飾がない場合でも相乗的に作用して表面と相互作用することができます。したがって、ジスルフィド架橋の存在によって促進される全体的な剛性は、チロシンおよびリシン残基の溶媒への持続的な曝露を促進し、表面および/または他のタンパク質との相互作用を最大化しながら、表面および/または他のタンパク質との相互作用を最大化することで機能を果たすための主要な構造的特徴である可能性があります。エントロピーペナルティ。

フォールドと残基の分布は、Pvfp-5β が Perna viridis の接着プロセスの最前線のタンパク質である理由も説明します。その細長い形状と非常に多くの相互作用ホットスポットの露出は、海洋基材への接着に理想的です。この構造に基づいて、足糸プラークでは、アミロイド線維のクロスβのように、さまざまなモノマーが線維の主軸に垂直に相互作用しながら積み重なることが容易に予測できます（図1）。 5)。他の足根プラークの構成要素を考慮すると、複合体が 2 つの EGF モジュール間の非構造化リンカーによって形成された裂け目の一部を露出させると合理的に仮定できます。この裂け目は、線維形成に寄与する可能性のある他の足のタンパク質を収容できる可能性があります。

Pvfp-5β の細長い形状と多くの相互作用ホットスポットの露出は、繊維形成に理想的です。アミロイド線維のクロスβのように、異なるユニットが線維の主軸に垂直に相互作用しながら積み重なる可能性があります。

最後に、溶液の pH と塩濃度を変えるだけでコアセルベーションが観察されることから、LLPS にも DOPA は必要ないことを実証しました。以前の研究で観察された異なる挙動 30 も、サンプルの異なる性質によって説明できる可能性があります。これは、DOPA が接着に必須ではないことを示す私たちの結果や他の研究者の結果と完全に一致しています 17,22。

結論として、我々の研究は、分子レベルでイガイタンパク質の分子認識を理解するための直接的な構造的試みを構成し、イガイの足根プラーク形成のモデルを提供する。私たちの結果は、DOPAがPvfp-5βコアセルベーションにとって重要であるにもかかわらず、実験的証拠と一致してこのタンパク質の接着特性に寄与しない理由を説明する可能性があります17,22。 DOPA は、コアセルベート内のモノマーの充填とより効果的な架橋を容易に促進し、その安定性に貢献します。イガイの接着におけるコアセルベーションのプロセスについては、いくつかの疑問が残されています。たとえば、複雑な化学量論やさまざまな成分の相対的な寄与、あるいは起こる可能性のある事象の正確な反応速度はわかっていません。また、DOPA の存在が結合モードにどのような影響を与えるのかも正確にはわかりません。したがって、これらの重要な未解決の問題に対処するには、さらに多くの作業が必要になります。

クローニング、大腸菌での細菌発現、および精製は、若干の調整を加えて以前に発表されたとおりに達成されました17。簡単に説明すると、組換え Pvfp-5β を、TEV プロテアーゼで切断可能な N 末端 His タグ付きタンパク質として BL21(DE3)pLysS E.coli 細胞内で発現させました。発現は、1 mM イソプロピル-β-d-1-チオガラトピラノシドにより 37 °C で 3 時間誘導されました。標識は、唯一の窒素および炭素源として15N硫酸アンモニウムおよび13Cグルコースを使用する最小培地中で細胞を増殖させることによって達成された。細胞を超音波ホモジナイザーで破砕した。封入体を、ｐＨ７．４の８Ｍ尿素、１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＤＴＴ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再可溶化した。上清を、Ni-セファロース(GE Healthcare Life Sciences)を予め充填した5ml HisTrap FF粗製カラムに通した。タンパク質は、イミダゾールの直線勾配による変性および還元条件下で溶出されました。次に、最初に 20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.4)、2 M 尿素、250 mM NaCl、2 mM 還元グルタチオン (GSH)、および 0.5 mM 酸化グルタチオン (GSSG) 中で、4 °C で広範な透析によってリフォールディングを実行しました。尿素を含まない同じ緩衝液、そして最後にｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムおよび２５０ｍＭＮａＣｌ中で。 His タグの除去は、TEV プロテアーゼをタンパク質溶液に 1:50 のモル比で添加し、室温で 2 時間インキュベートすることによって実行されました。切断されたPvfp-5βを逆IMACクロマトグラフィーによって回収した。強力な接着特性のため、切断された Pvfp-5β は予想どおりカラムフロースルーに収集されませんでしたが、イミダゾールの段階勾配で溶出され、タグから分離できました。次に、20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.4) および 250 mM NaCl 中で広範な透析を 4 °C で実行してイミダゾールを除去し、次に 5% 酢酸中で広範な透析を実行して、タンパク質サンプルの凍結乾燥を容易にしました。タンパク質の純度は、SDS-PAGE 分析によって検証されました。タンパク質濃度は、280 nmでのUV分光光度測定によって評価しました（吸光係数[ε] = 26080 M-1 cm-1）。

共鳴帰属のための三次元 NMR 測定は、Bruker 分光計の 800 MHz および 298 K で実行されました。T1、T2、および異核 NOE は、Bruker 分光計の 600 MHz と 800 MHz および標準パルスシーケンスを使用して 298 K の両方で測定されました。 2 つの異なるサンプルを 20 mM 酢酸緩衝液 pH 4.5 で調製し、1 つは約 350 μM の濃度で、もう 1 つは約 900 μM の濃度で調製しました。すべての NMR スペクトルは nmrPipe47 を使用して処理され、CCpnmr ソフトウェア 48 によって分析されました。

15N,1H HSQC49 ピークにより骨格アミド基の共鳴を特定することができ、HN(CO)CACB50、HN(CO)CA51、および HNCA52、HNCACB53 実験の分析によって対応するアミノ酸に割り当てられ、化学シフト値も得られました。 Cα および Cβ 原子の配列特異的な割り当てにつながります。 HNCO54 スペクトルを使用してカルボニル炭素の化学シフトを割り当て、Hα および Hβ の化学シフト値は HBHA(CO)NH55 および HBHANH56 実験によって割り当てました。 75 個の非プロリン残基のうち 73 個の HN、N 共鳴が割り当てられ、HA、CA、CB、および CO の割り当てられた共鳴とともに TALOS + ソフトウェア 57 で使用され、二面角 ψ および ϕ の経験的予測に使用されました。二次構造。

側鎖の割り当ては 3D HCCH-TOCSY58 実験によって実行され、脂肪族鎖と芳香族鎖について個別に記録されました。 2D (HB)CB(CGCD)HD59 および (HB)CB(CGCD)CEHE60 スペクトルを使用して、芳香族残基の Hδ および Hε プロトンを割り当てました。欠落している共鳴は 13C NOESY-HSQC61 によって割り当てられました。

Pvfp-5βの構造はARIA2.362を用いて計算した。入力データは、Pvfp-5β アミノ酸配列、化学シフト割り当てリスト、NOE 拘束リスト、TALOS+ で得られた二面角、および Rosetta タンパク質モデリングスイート 63 で得られた水素結合でした。以前の質量分析分析によれば、ジスルフィド架橋制約は C13-C29、C31-C40、C45-C56、C50-C67、および C69-C78 ペアにも課されました 17。緩和測定によって示唆されたように、C8 および C19 を含む追加のジスルフィド結合を課す追加の構造計算が実行されました。 NOE 制約は、脂肪族領域 (0 ～ 6 ppm) を中心とする 3D 15N NOESY-HSQC64、3D 13C NOESY-HSQC61、および芳香族領域 (6 ～ 8 ppm) を中心とする 3D 13C NOESY-HSQC の分析によって手動で割り当てられました。あいまいな NOE 割り当ては、8 回の反復を通じて ARIA によって自動的に並べ替えられ、各反復で最良の 100 個の配座異性体が選択されました。反復ごとに異なる違反しきい値が設定されました。it0 は 200.0、it1 は 6.0、it2 は 3.0、it3 は 2.0、it4 と it5 は 1.0、it6 から it8 は 0.5 です。エネルギー値が最も低い配座異性体を使用して、距離制約を偽陽性からフィルターし、曖昧さを割り当てました。 ARIA 計算は、違反許容度を適応的に選択して実行されました。 NOESY ピークリスト周波数の割り当て許容差は、1H については 0.02 ppm、15N および 13C 核の両方については 0.4 ppm でした。水素結合の制限は、T18-Y30、K20-K28、T55-S68、および G57-Y66 のペアに課されました。対数調和距離拘束ポテンシャルが仮定されました。この可能性は、NOE と導出された距離が理想的には対数正規分布に従うことを示すベイジアン分析から得られます 65,66。対数調和ポテンシャルは、模擬焼鈍の第 2 冷却段階中および水の精製中に適用されました。構造アンサンブルは、Chimera と Pymol67,68 を使用して視覚化および分析されました。品質検証は、PROCHECK69 およびタンパク質構造検証ソフトウェアスイート (PSVS、https://www.bio.tools/psvs#!) を使用して実行されました。

Pvfp-5β のアミド 1HN 化学シフト温度係数は、800.03 MHz の陽子周波数で動作する Bruker 分光計を使用して、283、288、293、298、および 303 K で一連の二次元 15N,1H HSQC スペクトルを記録することによって決定されました。すべてのスペクトルは各温度の水信号を参照し、nmrPipe47 を使用して処理し、CCpnmr ソフトウェア 48 で分析しました。水の化学シフトは 3-(トリメチルシリル)プロパン-1-スルホン酸 (DSS) を参照しました。DSS は温度依存性が無視できるため、重水素ロックアーティファクトによる偏りのない分析が可能です。すべての残基の化学シフト値 δHN を温度の関数としてプロットしました。データは、dδHN/dT < –5 ppb/K の残基は弱い水素結合を形成し、二次構造の切断点、または非構造領域にある場合は水との水素結合の促進剤として考慮されるべきであると仮定して分析されました。 dδHN/dT > –5 ppb/K の値は、二次構造要素に関与している可能性が高いより強固な結合の形成に対応します70。

Pvfp-5β のバックボーンダイナミクスは、298 K で 15N-R1、15N-R2 緩和および {1H}-15N 異核核オーバーハウザー効果 (hetNOE)71,72,73,74 を用いて、2 つの異なる磁場 (14.1 および 18.8) の下でプローブされました。た）。 15N-R1、15N-R2、および {1H}-15N NOE は、18.8 T の磁場のみの下で他の 3 つの温度 (288、293、および 303 K) でも測定されました。すべての場合において、R1 と R2 は遅れて測定されました。それぞれ、0.01 ～ 2 秒、および 0.017 ～ 2.7 秒の間で変化します。 {1H}-15N 定常状態 NOE データは、2 つのスペクトルを測定することによって得られました。1 つは初期プロトン飽和なしで記録された最初のスペクトル、もう 1 つは 8 秒の初期プロトン飽和で記録された 2 番目のスペクトルです。次いで、プロトン飽和がある場合とない場合のピークの平均強度の比からNOE値を決定した。

298 K で取得された緩和データ、および 18.8 T と 14.1 T の磁場の両方で取得された緩和データは、Bruker のトップスピンプラットフォームが提供する Dynamic Center ツールで利用可能な標準的な数学的モデルフリー形式 75 によって分析されました。実験データは、5 個と 6 個のジスルフィド架橋を持つ 2 つの異なる構造を使用して処理およびフィッティングされました。さまざまな温度で取得された緩和データのさらなる分析は、スペクトル密度関数アプローチを使用して実行されました 31,32。温度は、選択したピークの化学シフト変化を監視することによってチェックされました。高周波パルスを加えた結果としてサンプルの過熱は観察されませんでした。存在する 83 アミノ酸のうち、15 残基はプロリンであるため、または 15N HSQC での重複のため、分析から除外されました (P5、P7、P10、Y11、P12、C13、G37、A44、P47、P49、Y58) 、Y60、P63、P70、G75）。

Pvfp-5β の構造モデルは、RoseTTafold suite を使用して取得されました 76。これは、アミノ酸配列からタンパク質の構造を予測できる深層学習ネットワークに基づく計算ツールの 1 つです。深層学習ネットワークは、一連の 1D、2D、および 3D 畳み込み演算を実行して、結果として得られるタンパク質構造モデルの精度を高めることができます。複数の配列アラインメント、距離マップ、および 3 次元座標表現の組み合わせにより、複数の配列アラインメントとコンタクトマップに基づく従来の予測方法と比較して、より優れた構造モデルが生成されます。ソフトウェアは 5 つのモデルを生成しました。その違いは、配列内の各残基の位置に対するオングストローム誤差推定値として強調表示されます。予測の良さは、DeepAccNet77 で使用される予測 IDDT (局所距離差分テスト) に関連する信頼度によって定義されます。 Pvfp-5β の信頼度は 0.92 でした。

凍結乾燥したPvfp-5βを、最終濃度10mg/mlになるまで10mM酢酸に溶解した。次いで、溶液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）または０．１Ｍトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ＭＮａＣｌ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、４０μＭのＴｈＴ水溶液で染色した。 250 マイクロリットルの染色サンプルを顕微鏡チャンバー付きスライド上に置き、Leica TCS SP5 共焦点レーザー走査型顕微鏡、63 倍油対物レンズ (Leica Microsystems、ドイツ) を使用して 1024 × 1024 ピクセルの解像度で画像化しました。ライカ白色光レーザーは 470 nm 励起に設定され、ThT 発光は 485 ～ 585 nm の範囲で検出されました。

FLIM データは、63 倍の油対物レンズ (Leica Microsystems) を使用して、picoHarp 300 スタンドアロン TCSPC モジュール (Picoquant) によって時間領域で取得されました。 256 × 256 ピクセルの画像は、ThT (λex: 470 nm、λem: 485 ～ 585 nm) を励起するように設定された Leica 白色光レーザーを使用して、200 Hz の走査周波数で取得されました。システムの FLIM キャリブレーションは、4.0 ns の単一寿命であるフルオレセインの既知の寿命を測定することによって実行されました。 FLIM データは、カリフォルニア大学アーバイン校の蛍光力学研究所 (www.lfd.uci.edu) で開発された SimFCS ソフトウェアによるフェーザーアプローチ 42,43 によって分析されました。フェーザー手法は、FLIM 測定のグラフ分析を可能にするフーリエ領域手法です。画像の各ピクセルで測定された蛍光減衰を極座標表現の「フェーザー」と呼ばれる単一点に変換します。考えられるすべての単一指数関数的減衰は、τ = ∞ に対応する点 (0, 0) から τ = に対応する点 (1, 0) まで、半径 1/2 の半円 (ユニバーサル円として定義) 上にあります。 0. 複素減衰は単一指数関数の線形結合であり、半円内で表されます。フェーザがベクトル代数に従うことを考えると、ベクトル加算のてこの規則によって 2 つの蛍光種の分数 (最も単純な場合) を幾何学的に解決することが可能です。 2 つの単一指数関数的減衰成分の線形結合により、普遍円内にフェーザーが生成されます。フェーザーは、2 つの単一成分のフェーザーを結ぶ直線上にあります。 1 つの単一コンポーネントからの寿命への寄与/割合は、そのコンポーネントからのフェーザーの距離に比例します。

Pvfp-5β 測定の場合、寿命分布は緑、シアン、赤のカーソルで選択され、対応するピクセルは画像内の同じカラーコードで局在化されました。緑色のピクセルは寿命が短いことに関連しています。徐々に増加する寿命は、シアンと赤色を使用してマッピングされます。

Pvfp-5β/Pvfp-5β複合体のタンパク質間相互作用のドッキング計算は、統合モデリングプラットフォームHADDOCK2.478,79を使用して非経験的に実行されました。 HADDOCK ドッキングプロトコルでは、初期段階では相互作用パートナーが剛体として扱われますが、第 2 段階では、界面パッキングを最適化するために 3 段階の分子動力学に基づく改良を通じて相互作用パートナーに柔軟性が導入されます。次に、界面領域に属する残基は、2 番目の精製ステップで側鎖を移動することができます。次に、相互作用のエネルギー学を改善するために、溶媒シェルでの最終的な改良が実行されます。結果として生じるタンパク質間複合体は、HADDOCK スコアの関数としてランク付けされます。HADDOCK スコアは、静電エネルギー、ファンデルワールスエネルギー、距離拘束エネルギー、埋没表面積などのいくつかの項の加重合計です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

NMR 割り当ては、アクセッション番号 51091 で BioMagResBank (BMRB: www.bmrb.wisc.edu、https://doi.org/10.1093/nar/gkm957) に提出されました。NMR 構造座標は、Protein Data に登録されています。銀行 (PDB: www.rcsb.org、https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7000-1_26)、アクセッションコード 7QAB。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。

リー、Ｘら。海洋生物におけるタンパク質を介した生体接着: 総説。 3月環境。解像度 170、1–15 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Jo, YK, Kim, HJ, Jeong, Y., Joo, K. II & Cha, HJ 組換えイガイ接着タンパク質を使用した生体材料の生体模倣表面工学。上級メーター。インターフェース 5、1 ～ 13 (2018)。

記事 Google Scholar

Xu, X.、Chen, X. & Li, J. 硬組織の再生のための天然タンパク質の生物インスピレーションを受けた材料。 J. メーター。化学。 B 8、2199–2215 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Harrington, MJ、Jehle, F. & Priemel, T. イガイ足根の構造 - 先端材料のバイオテクノロジー生産のインスピレーションとしての機能と製造。バイオテクノロジー。 J. 13, 1–11 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

待ってください、JH Mussel の接着 - 重要なフットワーク。 J.Exp. バイオル。 220、517–530 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Priemel, T.、Degtyar, E.、Dean, MN & Harrington, MJ イガイの足根バイオファブリケーション中の複雑な生体分子構造の迅速な自己集合。ナット。共通。 8、1–12 (2017)。

記事 Google Scholar

Astoricchio, E.、Alfano, C.、Rajendran, L.、Temussi, PA & Pastore, A. コアセルベートの広い世界: 海から神経変性まで。トレンド生化学。科学。 45、706–717 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Taylor, P.、Bandara, N.、Zeng, H. & Wu, J. 海産貝の付着: 生化学、メカニズム、および生体模倣。Ｊ．接着剤。科学。テクノロジー。 27、2139–2162 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Cha、HJ、Hwang、DS、Lim、S。海洋貝からの生体接着剤の開発。バイオテクノロジー。 J. 3、631–638 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ge, L. & Chen, S. 臨床医学における組織接着剤の最近の進歩。ポリマー 12、1–22 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Yu, M.、Hwang, J. & Deming, TJ イガイ接着タンパク質における 1-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンの役割。混雑する。化学。社会 121、5825–5826 (1999)。

記事 CAS Google Scholar

ファン・DSら。イガイ接着斑における顕著なタンパク質のタンパク質依存性および金属依存性相互作用。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 285、25850–25858 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, H.、Scherer, NF & Messersmith, PB イガイ接着の単一分子力学。手順国立アカデミー。科学。 USA 103、12999–13003 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーソン、TH et al. 基質とペプチドの接着およびイガイ由来の合成ペプチドフィルムの内部凝集に対する DOPA の寄与。上級機能。メーター。 20、4196–4205 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リン、Ｑら。イガイ足タンパク質 mfp-1 および mfp-3 の接着メカニズム。手順国立アカデミー。科学。 USA 104、3782–3786 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu、Q.ら。イガイの足のタンパク質のさまざまな基材表面への接着。 JR協会インターフェース 10、1–11 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

サントノシト、R.ら。組換えイガイタンパク質 Pvfp-5β: 潜在的な組織生体接着剤。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 294、12826–12835 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Petrone, L. et al. イガイの接着は、時間によって調節されるイガイ接着タンパク質の分泌と分子構造によって決定されます。ナット。共通。 6、1–12 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Hwang, DS & Waite, JH 3 つの本質的に構造のないイガイ接着タンパク質、mfp-1、mfp-2、および mfp-3: 円二色性による分析。タンパク質科学。 21、1689–1695 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

イガイ接着斑タンパク質遺伝子は、上皮成長因子様遺伝子ファミリーの新規メンバーです。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 270、6698–6701 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hwang, DS、Zeng, H.、Lu, Q.、Israelachvili, J. & Waite, JH 緑イガイ由来の DOPA 欠損足タンパク質における接着メカニズム。ソフトマター 8、5640–5648 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bilotto、P. et al. ドーパとチロシンのレベルが異なる 2 つの組換えイガイ足タンパク質の吸着層の接着特性。ラングミュア 35、15481–15490 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Maier、GP、Rapp、MV、Waite、JH、Israelachvili、JN、および Butler、A。カテコールとリジンの間の適応的な相乗効果により、表面塩置換による湿潤接着が促進されます。サイエンス 349、628–632 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shin, M. et al. リジンの位置は、水中でのイガイの接着におけるカテコール媒介の表面接着と凝集を制御します。 J. コロイド界面科学。 563、168–176 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ou, X. et al. イガイ接着タンパク質の構造と配列の特徴は、その耐塩性接着能力につながります。科学。上級 6、1–11 (2020)。

記事 Google Scholar

Zhang、C.ら。ポリドーパミン/アミンの相乗効果による表面塩置換による、強靭で耐アルカリ性のイガイ由来の湿潤接着力。ラングミュア 35、5257–5263 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マサチューセッツ州ゲビーら。カチオン-φ相互作用による水中接着の調整。ナット。化学。 9、473–479 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェイ、W.ら。イガイ由来の一成分接着剤コアセルベート。アクタバイオメーター。 10、1663–1670 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キム、S.ら。ムール貝からインスピレーションを得た、同様に荷電した高分子電解質の錯体形成とコアセルベーション。手順国立アカデミー。科学。 USA 113、E847–E853 (2016)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deepankumar, K. et al. ミドリイガイ接着タンパク質 Pvfp-5 の液液相分離は、翻訳後のドーパアミノ酸によって制御されます。上級メーター。 2103828、1–10 (2021)。

Google スカラー

Křížová, H.、Žídek, L.、Stone, MJ、Novotny, MV & Sklenář, V. フェロモン 2-sec-buty1-4 と複合体を形成した主要な尿中タンパク質 I の骨格動態のモニタリングに適用された温度依存スペクトル密度分析、5-ジヒドロチアゾール。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 28、369–384 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

モーリン、S. 溶液中の 15N スピン緩和からのタンパク質ダイナミクスの実践的なガイド。プログレ。 Nucl. マグニチュードレゾン。分光器。 59、245–262 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ニュージャージー州バクスター & 国会議員ウィリアムソンタンパク質の 1H 化学シフトの温度依存性。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 9、359–369 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kim, DE、Chivian, D. & Baker, D. Robetta サーバーを使用したタンパク質構造の予測と分析。核酸研究所 32、W526–W531 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chivian, D. et al. robetta サーバーを使用した CASP-5 構造の自動予測。タンパク質の構造。機能。ジュネット。 53、524–533 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

LeVine, H. チオフラビン T を用いた β シートアミロイド原線維構造の定量化。Methods Enzymol。 309、274–284 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Shen、Y.ら。生体分子の凝縮物は、一般的なせん断媒介の液体から固体への転移を起こします。ナット。ナノテクノロジー。 15、841–847 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Abbas, M.、Lipin´ski, WP、Lipiński, L.、Wang, J. & Spruijt, E. 生体模倣プロトセルとしてのペプチドベースのコアセルベート。化学。社会改訂 50、3690–3705 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Suhling、K.ら。 ScienceDirect 蛍光寿命イメージング (FLIM): 基本概念といくつかの最近の開発。医学。光子。 27、3–40 (2015)。

記事 Google Scholar

Biancalana, M. & Koide, S. アミロイド原線維へのチオフラビン T 結合の分子機構。ビオチム。生物物理学。アクタタンパク質プロテオム。 1804 年、1405 ～ 1412 年 (2010 年)。

記事 CAS Google Scholar

Stsiapura, VI et al. 分子ローターとしてのチオフラビン T: 異なる粘度の溶媒中でのチオフラビン T の蛍光特性。Ｊ．Ｐｈｙｓ．化学。 B 112、15893–15902 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Digman, MA、Caiolfa, VR、Zamai, M.、Gratton, E. 蛍光寿命イメージング解析へのフェーザーアプローチ。生物物理学。 J. 94、L14–L16 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ranjit, S.、Malacrida, L.、Jameson, DM、Gratton, E. フェーザーアプローチを使用した蛍光寿命イメージングデータのフィットフリー分析。ナット。プロトック。 13、1979 ～ 2004 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

De Luca、G. et al. インスリンアミロイド自己集合におけるアンサンブル多型性と単一凝集体の構造的不均一性を調査する。 J. コロイド界面科学。 574、229–240 (2020)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

Ascenzi, P. et al. ウシ塩基性膵トリプシン阻害剤 (クニッツ阻害剤): 画期的なタンパク質。カー。プロテインペプト。科学。 4、231–251 (2005)。

記事 Google Scholar

Kraemer-Pecore、CM、Lecomte、JTJ & Desjarlais、JR WW ドメインの新規再設計。タンパク質科学。 12、2194–2205 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Delaglio、F. et al. NMRPipe: UNIX パイプに基づく多次元スペクトル処理システム。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 6、277–293 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フランケン、WFら。 NMR 分光法用の CCPN データモデル: ソフトウェアパイプラインの開発。タンパク質の構造。機能。ジュネット。 59、687–696 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Palmer, AG、Cavanagh, J.、Byrd, RA & Rance, M. 三次元異核相関 NMR 分光法の感度向上。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 96、416–424 (1992)。

CAS Google スカラー

Grzesiekt, S. & Bax, A. 複数の中継三重共鳴 NMR による、より大きなタンパク質の主鎖アミドと側鎖の共鳴の相関。混雑する。化学。社会 114、6291–6293 (1992)。

記事 Google Scholar

Grzesiek, S. & Bax, A. 31 kDa タンパク質に適用された 3D 三重共鳴 NMR 技術の改良。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 96、432–440 (1992)。

CAS Google スカラー

Kay, LE、I Kura, M.、Tschudin, R. & Bax, A. 同位体濃縮タンパク質の三次元三重共鳴 NMR 分光法。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 89、496–514 (1990)。

CAS Google スカラー

Grzesiek, S. & Bax, A. 中型の同位体濃縮タンパク質の連続骨格割り当てのための効率的な実験。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 99、201–207 (1992)。

CAS Google スカラー

Muhandiram, DR & Kay, LE 感度が向上した勾配増強三重共鳴三次元 NMR 実験。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。サー。 B 103、203–216 (1994)。

記事 CAS Google Scholar

Grzesiek, S. & Bax, A. 均一に 13C/15N が豊富なタンパク質の逐次割り当て手順におけるアミノ酸タイプの決定。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 3、185–204 (1993)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lian, LY & Roberts, G. タンパク質 NMR 分光法: 実践的な技術と応用。 (ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・リミテッド、2011)。

Shen, Y.、Delaglio, F.、Cornilescu, G.、Bax, A. TALOS+: NMR 化学シフトからタンパク質骨格のねじれ角を予測するハイブリッド手法。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 44、213–223 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bax, A.、Clore, GM および Gronenborn, A. 13C 磁化の等方性混合による 'H-'H 相関、13C 富化タンパク質の 1H および 13C スペクトルを割り当てるための新しい 3 次元アプローチ。Ｊ．Ｍａｇｎ． Reson 88、425–431 (1990)。

CAS Google スカラー

yamazaki, T.、Forman-Kay, JD & Kay, LE スカラーカップリングを介して 13C 標識タンパク質の芳香族残基の 13Cβ および 1Hδ/ϵ 化学シフトを相関させるための 2 次元 NMR 実験。混雑する。化学。社会 115、11054–11055 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

Torizawa, T.、Ono, AM、Terauchi, T. & Kainosho, M. タンパク質中のフェニルアラニンおよびチロシン残基の芳香環共鳴の NMR 帰属法。混雑する。化学。社会 127、12620–12626 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Baur, M.、Gemmecker, G. & Kessler, H. 均一に標識されたタンパク質の分解能を高めるための分割炭素進化を備えた 13C-NOESY-HSQC。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 132、191–196 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rieping, W.、Bardiaux, B.、Bernard, A.、Malliavin, TE & Nilges, M. ARIA2: NMR 構造計算における自動 NOE 割り当てとデータ統合。バイオインフォマティクス 23、381–382 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kaufmann, KW、Lemmon, GH、Deluca, SL、Sheehan, JH & Meiler, J. 実際に役立つ: R osetta タンパク質モデリングスイートができること。生化学 49、2987–2998 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zuiderweg、ERP & Fesik、SW 炎症性タンパク質 C5a の異核三次元 NMR 分光法。生化学 28、2387–2391 (1989)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mareuil, F.、Malliavin, TE、Nilges, M.、Bardiaux, B. ARIA による自動 NMR 構造計算の信頼性、精度、品質が向上しました。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 62、425–438 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

溶液および固体 NMR については、Bardiaux, B.、Malliavin, T.、Nilges, M. ARIA。方法Ｍｏｌ．バイオル。 831、453–483 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Yuan, S.、Chan, HCS & Hu, Z. 計算による薬剤設計のプラットフォームとして PyMOL を使用。ワイリー・インターディシプ。 Rev.Comput. モル。科学。 7、1–10 (2017)。

記事 Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF Chimera — 探索的研究と分析のための視覚化システム。Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．化学。 25、1605–1612 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Laskowski, RA、Rullmann, JAC、Maccarcer, MW、Kaptein, R. & Thornton、JM AQUA、および PROCHECK-NMR: NMR によって解析されたタンパク質構造の品質をチェックするためのプログラム。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 8、477–486 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cierpicki, T. & Otlewski, J. タンパク質の水素結合指標としてのアミドプロトン温度係数。Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ． NMR 21、249–261 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gáspári, Z. & Perczel, A. NMR によって報告されたタンパク質の動態。アンナ。 NMR分光担当者。 71、35–75 (2010)。

記事 Google Scholar

Palmer, AG 前後をダイナミックに見つめる。Ｊ．Ｍａｇｎ．レゾン。 266、73–80 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mittermaier, A. & Kay, LE 新しいツールは、タンパク質動態の NMR 研究に新たな洞察を提供します。サイエンス 312、224–228 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kovermann, M.、Rogne, P.、Wolf-Watz, M. 溶液状態 NMR 分光法によるタンパク質のダイナミクスと機能。 Q. Rev. Biophys. 49、1–43 (2016)。

記事 Google Scholar

Lipari, G. & Szabo, A. 高分子における核磁気共鳴緩和の解釈に対するモデルフリーのアプローチ。 1. 理論と有効範囲。混雑する。化学。社会 104、4546–4559 (1982)。

記事 CAS Google Scholar

M、B.ら。 3 トラックニューラルネットワークを使用したタンパク質の構造と相互作用の正確な予測。サイエンス 373、871–876 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

平沼直也ほか深層学習ベースの精度推定によって導かれたタンパク質構造の改良の改善。ナット。共通。 12、1–11 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Van Zundert、GCP、Rodrigues、JPGLM、Trellet、M. & Schmitz、C. The HADDOCK2。 2 Web サーバー: 生体分子複合体のユーザーフレンドリーな統合モデリング。Ｊ．Ｍｏｌ．バイオル。 428、720–725 (2016)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

オノラト、RV 他クラウド内の構造生物学: WeNMR-EOSC エコシステム。フロント。モル。生物科学。 8、1–7 (2021)。

記事 Google Scholar

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Fondazione Ri.MED での作業は、Patto per il Sud Regional Siciliana—Grant "CheMISt" (CUP G77B17000110001) および PO FESR Sicilia 2014/2020 Azione 1.5.1 によって支援されました。—Grant "Potenziamento Infrastruttura di Ricerca "GMP Facility, Laboratori di Ricerca e Servizi Diagnostici e Terapeutici IRCCS-ISMETT" (CUP G76G17000130007)、パートナーシップ IRCCS-ISMETT/Fondazione Ri.MED. AP は、MRC 生物医学 NMR センターへのアクセスの提供を通じて、フランシスクリック研究所によってサポートされました。フランシスクリック研究所は、 Cancer Research UK (FC001029)、UK Medical Research Council (FC001029)、および Wellcome Trust (FC001029) からの主要資金提供を受けています。インフラストラクチャのサポートについては、パレルモ大学の ATeN センターに感謝します。また、Nadia Consiglio に感謝します。図5を実現するために親切に助けてください。

これらの著者は同様に貢献しました: Maria Agnese Morando、Francesca Venturella。

構造生物学および生物物理学ユニット、Fondazione Ri.MED、90133、パレルモ、イタリア

マリア・アニェーゼ・モランド、フランチェスカ・ヴェントゥレッラ、マルティナ・ソラッツォ、エリザ・モナカ、ラファエレ・サバテッラ、カテリーナ・アルファノ

生物学、化学および薬学科学および技術学部 (STEBICEF)、パレルモ大学、90128、パレルモ、イタリア

マルティナ・ソラッツォ

物理化学学部 - エミリオセグレ (DiFC)、パレルモ大学、90128、パレルモ、イタリア

ヴァレリア・ヴェトリ

生物物理研究所、国立研究評議会、90143、パレルモ、イタリア

ローザ・パッサンティーノ

欧州シンクロトロン放射施設、Ave des Martyrs、38000、グルノーブル、フランス

アナリサ・シェパード

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CA と AP の概念化。 FV、EM、RS、および RP サンプルの準備; CA、MAM、および MS データの取得。 MAM、FV、MS、VVAP、および CA データ分析。 AP および CA のデータキュレーション。 AP と CA が原稿を書きました。 CA の監督、リソース、資金の獲得。

カテリーナ・アルファノへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

この原稿は、別の Nature Portfolio ジャーナルで以前にレビューされています。この原稿は、Communications Biology でのさらなる審査なしで出版に適していると考えられました。主な担当編集者: Gene Chong。

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転載と許可

マサチューセッツ州モランド、F. ヴェントゥレラ、M. ソラッツォ他組換え Pvfp-5β の溶液構造により、イガイの接着に関する洞察が明らかになります。 Commun Biol 5、739 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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受信日: 2022 年 2 月 2 日

受理日: 2022 年 7 月 11 日

公開日: 2022 年 7 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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